近日，記者從中國醫(yi)學(xue)(xue)科(ke)學(xue)(xue)院醫(yi)藥(yao)生(sheng)物技(ji)術研(yan)(yan)究所獲悉，由該所微生(sheng)物代謝工(gong)程室主(zhu)任王以光研(yan)(yan)究員主(zhu)持(chi)(chi)研(yan)(yan)究的(de)必(bi)特霉(mei)素及其基因(yin)(yin)工(gong)程高產菌株(zhu)獲我國專利。該專利發明(ming)涉及必(bi)特霉(mei)素基因(yin)(yin)工(gong)程菌株(zhu)在維持(chi)(chi)異源基因(yin)(yin)整(zheng)合(he)狀態下，通過誘(you)變、自然分離等手段提高整(zheng)合(he)型菌株(zhu)發酵(jiao)產生(sheng)必(bi)特霉(mei)素的(de)能力，獲得的(de)高產菌株(zhu)比質(zhi)粒(li)型菌株(zhu)發酵(jiao)效價有(you)較大的(de)提高，從而(er)為(wei)工(gong)業化(hua)生(sheng)產奠定(ding)了基礎。
據介紹(shao)，必特霉素(su)對(dui)革蘭(lan)(lan)氏(shi)陽(yang)性(xing)球菌(jun)(jun)有較強(qiang)(qiang)的(de)抗菌(jun)(jun)活性(xing)，尤(you)(you)其對(dui)肺炎(yan)支原(yuan)體(ti)的(de)抗菌(jun)(jun)活性(xing)強(qiang)(qiang)，對(dui)紅霉素(su)耐(nai)藥(yao)菌(jun)(jun)、流感嗜(shi)血(xue)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)、淋球菌(jun)(jun)、弓形(xing)(xing)體(ti)、軍團菌(jun)(jun)、脆弱擬桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)、產(chan)氣(qi)莢膜梭菌(jun)(jun)和多形(xing)(xing)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)有一定的(de)抗菌(jun)(jun)活性(xing)。必特霉素(su)在體(ti)內(nei)有較高的(de)親脂性(xing)，口(kou)服吸收快，組織(zhi)滲透(tou)性(xing)強(qiang)(qiang)，分(fen)布廣泛，體(ti)內(nei)維持時(shi)間長(chang)，有較好的(de)抗生素(su)后效應，與同類(lei)藥(yao)物沒有完全交叉耐(nai)藥(yao)性(xing)，將主要(yao)用于治療革蘭(lan)(lan)氏(shi)陽(yang)性(xing)菌(jun)(jun)感染性(xing)疾病，尤(you)(you)其是(shi)上呼吸道感染及泌尿系統的(de)感染等(deng)。
據王以(yi)光研究(jiu)員(yuan)介紹，基(ji)因工(gong)(gong)程(cheng)藥(yao)物必特霉(mei)素的研制曾得到國家(jia)“863”計(ji)劃的支持，現又(you)為(wei)國家(jia)“863”計(ji)劃2004年第三批新立項(xiang)項(xiang)目。該(gai)藥(yao)屬國內外(wai)首創的基(ji)因工(gong)(gong)程(cheng)抗生素，系利用基(ji)因克隆技術(shu)使螺旋霉(mei)素結(jie)構中碳霉(mei)糖(tang)的4"位羥基(ji)進行異(yi)戊酰基(ji)化，獲(huo)得的以(yi)異(yi)戊酰螺旋霉(mei)素為(wei)主要成分(fen)的新型(xing)抗生素。由于必特霉(mei)素是基(ji)因工(gong)(gong)程(cheng)菌發酵的直接產物，無需(xu)進行化學半合(he)成加工(gong)(gong)，因而(er)生產過程(cheng)環境(jing)污(wu)染(ran)少。
目前，該藥處于Ⅱ期臨床(chuang)試驗階段。
目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導入細胞的效率都不是百分之百的，因而最后生長繁殖出來的細胞并不同都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細胞只接受一個重組DNA分子。最后培養出來的細胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant）。將目的重組體篩選出來就等于獲得了目的序列的克隆，所以篩選(dcreening)是基因克隆的重要步驟。在構建載體，選擇宿主細胞、設計分子克隆方案時都必須仔細考慮篩選的問題。以下就常用技術的基本原理加以介紹。
一、根據重組載體的標志作篩選
最常見的載體攜帶的標志是抗藥性標志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四環素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。當培養基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個抗藥性標志就會消失。例如質粒pBR322含有anpr、和terr兩個抗藥基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉化大腸桿菌，讓細菌放在含氨芐青霉素或四環素培養基中，凡未接受質粒DNA的細胞都不能生長；凡在含氨芐青霉素和四環素中都能生長的細菌是含有質粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生長、而在四環素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質粒。
載體含有lacZ’的藍白篩選法，近年更被廣泛應用。例如將目的序列插入前面述及的質粒pUC19的多克隆位點，轉化大腸桿菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培養基中培養，凡能生長并呈白色的菌落，其細菌中就很可能含有插入目的序列的重組質粒，這樣就很容易獲得目的序列的克隆。
根據重組載體的標志來篩選，可以篩選去大量的非目的重組體，但還只是粗篩，例如細菌可能發生變異而引起抗藥性的改變，卻并不代表目的序列的插入，所以需要做進一步細致的篩選。
二、核酸雜交法
利用標記的核酸做探針與轉化細胞的DNA進行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉化后生長的菌落復印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標記，結合了放射性核酸探針的菌落集團可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質標記，通常是經顏色呈現指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。
三、PCR法
PCR技術的出現給克隆的篩選增加了一個新手段。如果已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設計合成一對引物，以轉化細胞所得的DNA為模板進行擴增，若能得到預期長度的PCR產物，則該轉化細胞就可能含有目的的序列。
四、免疫學方
利用特定抗體與目的基因表達產物特異性結合的作用進行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達產物的反應指示含有目的基因的轉化細胞，因而要求實驗設計要使目的基因進入受體細胞后能夠表達出其編碼產物。抗體可用特定的酶常用過氧化物酶、堿性磷酸酶等標記，結合酶標抗體處，酶可催化特定的底物分解而呈現顏色，從而指示出含有目的的基因的細胞集落位置。免疫學方法特異性強、靈敏度高，適用于從大量轉化細胞集合體中篩選很少幾個含目的基因的細胞克隆。
五、DNA限制性內切酶圖譜分析
這是在上述篩選后的進一步分析。目的序列插入載體會使載體DNA限制性酶圖譜（restriction map）發生變化，例如一個長600bp的目的序列利用它兩端的EooR I和SalI切后的粘末端連接插入pUC19的多克隆點，則重組質粒就增大為3.3kb，用Eoor I和SalI雙酶切后會出現600bp和-2.7kb兩個DNA片段，提取轉化細菌的質粒DNA作酶切后做電泳觀察其酶切圖譜，就能分析得結果；如插入的目的序列中有其它限制性內切酶位點，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。這就可以進一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列測定
所得到(dao)的(de)(de)目的(de)(de)序(xu)列(lie)或基因的(de)(de)克(ke)隆(long)(long)，都(dou)要(yao)用(yong)其(qi)核酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)測(ce)定(ding)來最后鑒(jian)定(ding)。已知(zhi)序(xu)列(lie)的(de)(de)核酸(suan)(suan)克(ke)隆(long)(long)要(yao)經序(xu)列(lie)測(ce)定(ding)確(que)證所獲得的(de)(de)克(ke)隆(long)(long)準確(que)無誤；未知(zhi)序(xu)列(lie)的(de)(de)核酸(suan)(suan)克(ke)隆(long)(long)要(yao)測(ce)定(ding)序(xu)列(lie)才能(neng)確(que)知(zhi)其(qi)結構、推測(ce)其(qi)功能(neng)，用(yong)進一步的(de)(de)研(yan)究。因此核酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)測(ce)定(ding)是分子克(ke)隆(long)(long)中必不可少的(de)(de)鑒(jian)定(ding)步驟(zou)。核酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)測(ce)定(ding)的(de)(de)原(yuan)理和方法在實驗教材中有詳細的(de)(de)敘(xu)述(shu)。
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