2016年09月14日訊 地球上所有細胞生物的遺傳信息都儲存在數字化的DNA序列中。今天，基因測序技術已經非常發達，DNA序列可以非常廉價迅速的確定。但測序只是讀取數據，近年生物學最大的發現與發明之一是可編程的基因編輯技術：CRISPR-Cas9。這個技術類似于 WORD的搜索替換功能：用戶輸入一串字符串，程序找到匹配的字符串，然后進行刪除或者替換。CRISPR-Cas9 的編輯技術里，搜索匹配字符串由實驗人員通過一段 RNA表示，叫做導引 RNA -- gRNA，編輯由一個稱為 Cas9 的蛋白根據 gRNA 定位完成。這個編輯系統的靈活性顯而易見。Cas9 蛋白是固定的，你只需要改變導引就能在不同位置對DNA進行編輯。
CRISPR-Cas9 技術的來源是細菌的自然免疫系統。某些細菌在遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間。當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據存寫的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。有的細菌的CRISPR系統很復雜，涉及多種 Cas 蛋白 （Cas 的意思是 CRISPR-associated -- 與CRISPR相聯的 ）。經過多年的研究，生物學家們終于找到了一種簡單的系統，只用到一種蛋白 -- Cas9。接下來，他們成功把這個細菌的系統進行改造用于動植物細胞的基因編輯。率先完成這一實際應用性開發的是張鋒的研究小組。本文試圖對相關技術與歷史進行簡單的介紹。
這里我把CRISPR之前漫長的研究歷史一筆帶過。簡單而言，人們之前發現細菌免疫系統依靠一段很短的RNA進行識別，這段RNA稱為 crRNA （CRISPR RNA）。可想而知，這段 crRNA 包含有入侵病毒的基因識別碼。
CRISPR相關研究在2011年取得了重大突破。這一年，法國女科學家 Emmanuelle Charpentier 報告，通過基因分析與相關實驗，發現一個只有四個組件的細菌免疫系統。除了 Csn1 蛋白（后來稱為 Cas9）與 crRNA外，還發現一個他們稱之為 trans-activating CRISPR RNA（簡稱 tracrRNA）的RNA。顧名思義，這個 tracrRNA 起到轉寫-啟動的功能。第四個組件是一個作用于RNA的生成，稱為 RNase III的蛋白。但這篇2011年的論文對各個組件的具體功能并沒有完全確定。其論文中的下圖顯示 ：藍色是 Cas9 蛋白，紅色的是 tracrRNA， 綠色+黑色線段是 crRNA （其中綠色部分對應需要識別的病毒編碼），黃色是RNase III。
DOUDNA、Charpentier 聯合小組通過在細胞體外的試管實驗發現了負責DNA切割的充分并且必要的三個部分：Cas9， crRNA 與tracrRNA （不需要 RNase III）。論文還確定了三個部分的作用：其中Cas9 是切割機， crRNA 的主要作用是定位。而 tracrRNA 在與crRNA耦合后啟動 Cas9 的切割功能（activate）。他們還成功把 crRNA 與tracrRNA 連起來成為一個分子，這樣可以把 DNA 切割的組件由三個變成兩個。如上圖。左邊是自然原核細菌中的機制，兩個RNA分子。右邊則是人工機制，把兩個RNA給連起來了，成為一個帶著一個配對圈的RNA分子。但 DOUDNA 等人的實驗并沒有在任何細胞內進行，只是在細胞體外的試管里，當然也沒有在動植物等真核細胞內實驗，也不知道能否可行（ “it was not known whether such a bacterial system [the CRISPR-Cas9 system] would function in eukaryotic cells.”） 。
現在我們知道，Charpentier 2011年的論文出來后，美國東部 BROAD研究院的張鋒小組也展開了研究。在Doudna/Charpentier 2012年6月論文發表前半年，張鋒在2012年1月向NIH申請了一個項目：運用Cas9系統對真核細胞進行基因編輯。
上圖是一個哺乳動物 CRISPR 基因編輯系統的設計。其代碼進行表達后會生成四個部分（1）帶NLS的Cas9 蛋白，（2）tracrRNA ，（3）多個 crRNA -- 注意不同顏色的線段 （圖中稱為 guide RNA array），（4） 帶NLS的RNase III。真核細胞的特點是遺傳物質在細胞核內，一般較大的蛋白是進不去的。其中 的 NLS 是為了使 Cas9 等 生成后能夠被拖入細胞核內。可以這么說，張鋒的思路是先不管具體機制是什么，直接在高等生物上進行基因編輯實驗，而且多點編輯同時進行。
張的小組在2013年1月發表論文，報告了他們的發現：（1）他們對四個組件進行了組合實驗，發現基因編輯不需要 RNase III；（2）使用 Cas9 、crRNA 與 tracrRNA 組合，成功對真核細胞實現編輯，效率相當高（ indel 達19%）；（3）使用 DOUDNA 論文中的嵌合 RNA （chimera），發現長的那個（chimera A ）編輯效率較雙RNA系統低 （最高5.6%， 部分無法探測），短的那個 （chimera B） 不能編輯。
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